Временные методические указания по лабораторной диагностике инфекционной анемии лошадей.(Утверждены 25 марта 1983 г.)
1. Общие положения.
1.1. Инфекционная анемия лошадей – вирусная болезнь однокопытных животных, характеризующаяся рецидивирующей лихорадкой, анемией, а также бессимптомным вирусоносительством.
1.2. Лабораторный диагноз на инфекционную анемию устанавливают на основании результатов серологических (РДП), гематологических и патоморфологических исследований.
В сомнительных случаях для проверки особо ценных лошадей ставят биологическую пробу. При исследовании сывороток лошадей - продуцентов ставят групповую биопробу.
2. Взятие материала.
2.1. Для исследования в ветеринарную лабораторию доставляют: сыворотку крови лошадей (5-6 мл) для серологического исследования; кровь (10-12 мл), стабилизированную 20%-ным раствором лимоннокислого натрия, для гематологического исследования (кровь берут до поения и кормления животного); кусочки печени, селезенки, почек, сердца, легких и лимфатических узлов, взятых от павших или убитых с диагностической целью животных для гистологического исследования.
2.2. Сыворотку крови или дефибринированную кровь от подозрительных по заболеванию инфекционной анемией лошадей для постановки биопробы берут, как указано в п.6.
3. Серологическое исследование.
3.1. Серологический метод диагностики инфекционной анемии основан на обнаружении антител к вирусу этой болезни в сыворотке крови подозрительных по заболеванию лошадей путем постановки реакции диффузионной преципитации (РДП).
3.2. Исследование проводят в соответствии с «Методикой постановки реакции диффузионной преципитации (РДП) для серологической диагностики инфекционной анемии лошадей» рекомендованной Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 5 мая 1977 г.
3.3. Следует иметь в виду, что при остром течении болезни и коротком инкубационном периоде даже при наличии клинических симптомов, характерных для инфекционной анемии, у исследуемого животного могут быть получены отрицательные результаты серологического исследования (антитела в диагностическом титре накапливаются через 2-6 нед. после заражения). В связи с этим в таких случаях исследуют кровь повторно через 1—15 дней.
Необходимо также учитывать, что в случаях длительных ремиссий у хронически больных лошадей или латентного течения болезни положительная РДП может быть и при отсутствии клинических признаков и гематологических показателей.
4. Гематологические исследования.
4.1. Гематологические исследования включают определение количества эритроцитов в 1 мм3 крови, количества гемоглобина и скорости оседания эритроцитов (СОЭ).
4.2. Количество эритроцитов подсчитывают в камере Горяева. В пробирку с 4 мл 3%-ного раствора хлористого натрия вносят 0,02 мл крови. Форменные элементы считают в 80 маленьких или 5 больших квадратах, полученный результат умножают на 10000..
Подсчет эритроцитов можно провести и в электронном счетчике.
4.3. Гемоглобин определяют по общепринятому методу гемометром Сали и полученный результат выражают в г%.
4.4. Для определения СОЭ в эритросидиометр до отметки «0» наливают стабилизированную кровь и каждые 15 мин. учитывают в течение часа, а затем через 24 ч отмечают уровень оседания эритроцитов. Для больных лошадей характерна повышенная СОЭ, особенно в первые 15 мин. (60-70 делений). СОЭ определяют при комнатной температуре.
4.5. Сравнительные показатели крови здоровых и больных лошадей следующие:
Вид исследований / Показатели крови здоровых лошадей при нормальной упитанности / Показатели крови лошадей, больных инфекционной анемией
Эритроциты, млн./мм3 От 5 до 9              4,5 и ниже
Гемоглобин, г%                  7,6            5,0 и ниже
СОЭ (делений за 1 ч) 45-60            66 и более
4.6. Следует иметь в виду, что в начале заболевания при первом подъеме температуры резкие отклонения от нормы количества эритроцитов и процента гемоглобина, как правило, отсутствуют. У хронически больных инфекционной анемией животных эти показатели восстанавливаются до нормы, а СОЭ остается повышенной.
4.7. У лошадей с повышенной температурой тела следует исключить наличие нутталий, пироплазм.
5. Методика гистологического исследования.
5.1. Для гистологического исследования готовят срезы и окрашивают их гематоксилин-эозином общепринятым методом.
Срезы для исследования на гемосидерин окрашивают по Перлсу. Для этого срезы из чашки с дистиллированной водой переносят в смесь 2%-ного водного раствора желтой кровяной соли и 1%-ного водного раствора соляной кислоты (в пропорции на 2 капли первого раствора 1 мл второго). В этой смеси срезы выдерживают до появления синей окраски (15-20 мин.), после чего промывают их в течение 10 мин дистиллированной  водой, затем докрашивают 10 мин. 1%-ным раствором квасцового кармина. Далее проводят через спирты, карбол-ксилол и заключают в бальзам. Зернышки гемосидерина окрашиваются в голубой или зеленоватый цвет. При окрашивании срезов следует пользоваться только дистиллированной водой и стеклянными иглами (исключают железосодержащие предметы).
6. Постановка биологической пробы.
6.1. Для биологической пробы отбирают двух жеребят в возрасте 6-12 мес. (допускается использование более взрослых животных) из хозяйств, благополучных по инфекционным болезням.
Перед постановкой биопробы жеребят подвергают четырехкратным клинико-гематологическим и серологическим исследованиям с интервалом в 7 дней.
6.2. Для заражения жеребят берут стерильно от наиболее подозрительных по заболеванию инфекционной анемией лошадей кровь в количестве по 300-500 мл от каждой, лучше во время подъема температуры.
6.3. Жеребят заражают сывороткой крови или плазмой. При необходимости их фильтруют через фильтр Зейтца, затем фильтрат проверяют на стерильность и безвредность путем высева на питательные среды (МПБ, МПА, МППБ) и инъекции трем белым мышам подкожно в дозе 1 мл.
Если через 3 дня рост микрофлоры на питательных средах отсутствует и белые мыши остаются живыми, сыворотку крови вводят двум жеребятам подкожно или внутривенно в дозе 100-200 мл каждому. Дефибринированную кровь вводят только подкожно в той же дозе.
6.4. Групповую биопробу проводят путем заражения двух жеребят смесью сыворотки (плазмы) крови 10-15 лошадей-продуцентов. Смесь вводят подкожно в количестве 100-200 мл каждому жеребенку.
6.5. Наблюдения за зараженными животными ведут в течение 90 дней, при этом каждые 10-15 дней проводят гематологические и серологические исследования.
6.6. Биологическую пробу считают положительной при наличии у зараженных жеребят характерных клинических симптомов заболевания – рецидивирующей лихорадки, слабости, бледности или желтушности слизистых оболочек, исхудания и при получении положительных результатов серологических, гематологических исследований.
6.7. Жеребят, давших сомнительные результаты клинико-гематологических и серологических исследований, подвергают убою и исследуют патологоанатомически и гистологически. При положительном результате обнаруживают следующие патологоанатомические изменения: серозно-геморрагическую инфильтрацию подкожной и межмышечной клетчатки, гиперемию и отек лимфоузлов, зернистую или жировую дистрофию скелетной мускулатуры, миокарда, почек, множественные кровоизлияния на слизистых, серозных оболочках и под капсулой органов. Селезенка сильно гиперемирована, увеличена, с выраженной дольчатостью на разрезе, паренхима имеет мускатный рисунок.
Гистологические изменения соответствуют описанным в приложении.
6.8. Биопробу считают отрицательной при отсутствии у подопытных жеребят симптомов болезни и получении отрицательных результатов серологических и гематологических исследований.
7. Сроки исследований: серологического – 7 дней, гематологического – 2, гистологического – 14, биологического- 90 дней.
Приложение Патогистологические изменения при инфекционной анемии.
Характер и степень патогистологических изменений зависит от стадии болезни, количества рецидивов, ремиссий и их продолжительности.
При острой форме болезни обнаруживают: в печени – пролифераты эндотелия синусов и купферовских клеток со скоплением в синусах крупных гистиоцитов, содержащих гемосидерин, гистиоцитарно-лимфоидные пролифераты в междольковой соединительной ткани.
Печеночные клетки в состоянии жировой или зернистой дистрофии; в селезенке – пульпа инфарцирована эритроцитами и обеднена лимфоцитами, количество гемосидерина резко снижено или, наоборот, кровенаполнение слабое, а фолликулы гиперплазированы, количество гемосидерина в норме или несколько повышено; в почках и сердце – гиперемия, кровоизлияния, серозный отек интерстиция, слабые пролифераты гистиоцитарных и лимфоидных клеток, жировая или зернистая дистрофия, иногда небольшие отложения гемосидерина в эндотелиальных клетках и гистиоцитах; лимфатические узлы гиперемированы, с кровоизлияниями; в легких – кровоизлияния под плевру.
Хроническая форма болезни характеризуется следующими изменениями: в печени – диффузные пролифераты лимфоидных клеток и в меньшей степени мелких гистиоцитов, содержащих гемосидерин. У животных, павших в период тяжелого обострения, в печени находят скопления крупных гистиоцитов, нагруженных гемосидерином; в селезенке – диффузная гиперплазия и резкое уменьшение количества гемосидерина или его полное исчезновение. Кроме того, у лошадей, павших во время приступа, в селезенке отмечают повышенное кровенаполнение синусов и очаговое инфарцирование пульпы эритроцитами; в почках -  продуктивный гломерулонефрит, сосудистые клубочки увеличены и обогащены ядрами. Между канальцами и вокруг сосудов – скопления лимфоидных клеток. У животных, павших во время тяжелого лихорадочного приступа, в полости капсулы сосудистых клубочков находят серозный, а иногда серозно-геморрагический экссудат, гемосидерин находят в клубочках и гистиоцитах; в сердце – очаговый или диффузный интерстициальный миокардит с преимущественным поражением предсердий (особенно левого); в лимфатических узлах – лимфоцитоз и незначительное отложение гемосидерина; в легких – пролифераты лимфоидных клеток, а также гистиоцитов, нагруженных гемосидерином.
В поздних стадиях болезни в почках отмечают цирроз и склероз сосудистых клубочков. В сердце – миофиброз и склероз миокарда и эндокарда.
В период ремиссий изменения претерпевают обратное развитие или могут отсутствовать, за исключением стойких необратимых процессов: лимфоцитоз паренхимы селезенки, хронический гломерулонефрит, склероз эндо- и миокарда.